中国农业科学院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》发表了文献为《Targeted creation of new mtants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文献中采用了LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源来筛选GFP阳性的植株。

文献摘要

葫芦科的水果和蔬菜，如黄瓜、甜瓜、西瓜和南瓜，对人类饮食有很大贡献。基因组编辑技术的广泛使用极大地加速了基因功能表征和作物改良。然而，大多数经济上重要的葫芦科植物，包括甜瓜和南瓜，仍然对标准的根癌农杆菌介导的转化具有抗拒性，从而限制了基因组编辑技术的有效使用。在本研究中，我们采用“佳渗透强度"策略建立了的甜瓜和南瓜遗传转化系统。我们利用这种方法的力量来靶向ERECTA的同源物受体激酶基因家族，并创造了等位基因，导致甜瓜、南瓜和黄瓜中节间较短的紧凑植物结构。此处介绍的优化转化方法能够实现稳定的 CRISPR/Cas9 介导的诱变，并为葫芦科作物的功能基因操作提供了坚实的基础。

葫芦科长期以来被认为是难转化的作物之一，严重阻碍了基因组编辑工具的应用。在黄瓜和西瓜中已经报道了成功的遗传转化和基因组编辑[ 13 , 14 ]。然而，黄瓜的转化效率仍然很低，用于西瓜再生的间接器官发生目前与其他葫芦科作物不兼容。因此，其他经济上重要的葫芦科作物，如甜瓜和南瓜，仍然难以稳定转化，这极大地阻碍了功能基因组研究和快速产生赋予这些作物理想性状的突变。

农杆菌浸润被认为是建立稳定的遗传转化系统的关键。在器官发生过程中，不定芽从不同植物物种的原形成层或形成层细胞开始 [ 25 ]，这些组成了农杆菌感染的靶组织。然而，尽管以前的研究认识到需要感染外植体的更深细胞层，但尚未开发出统一的标准协议来实现这一目标。在实践中，必须在感受态细胞的充分感染和整个外植体的过度感染之间取得良好的平衡，这会导致严重的损伤并降低转化效率。

为了克服这些问题，我们采用了佳强度的浸润策略来确定特定的一组条件，以确保血管组织中的形成层细胞*感染，同时对外植体造成尽可能小的损伤。在这里，我们确定了真空渗透、超声处理和微刷的佳强度，以获得良好的甜瓜和南瓜转化效率，我们还在培养基中添加了抗氧化剂 LA，以保护外植体免受损伤。在这些优化的条件下，维管组织感染有效，外植体损伤小，导致甜瓜和南瓜的稳定遗传转化，效率约为4%。使用相同的策略，我们提高了不同黄瓜种质的转化效率，并部分克服了基因型依赖性。

这种在葫芦科作物中且稳定的遗传转化系统使我们能够在这些物种中进行 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑。拟南芥ER基因家族编码富含亮氨酸的重复受体样激酶，已被证明可调节茎伸长 [ 27 ]。编辑瓜类ER同源物在甜瓜、南瓜和黄瓜中产生了er突变体。所有突变体都具有较短的节间和矮化表型，这可能有利于改善植物结构和育种。

总之，我们提出了一种稳定的甜瓜和南瓜遗传转化系统，并证明 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑在这些葫芦科作物中是有效的。这里描述的方法将大大加快对葫芦科作物的研究，包括基础植物生物学和优良品系的创造。

植物材料和生长条件

本研究分析了十个甜瓜品种：P147（栽培甜瓜）、ivf105（栽培甜瓜） 、m1（栽培甜瓜）、m2（栽培甜瓜）、m3（栽培甜瓜）、m4（栽培甜瓜）、m5（野生甜瓜） , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉（商业杂交种），其中 ivf105 和 m1 到 m7 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所（IVF）王怀松提供。本研究使用黄瓜自交系Cu2（华南型）、新太米刺（华北型）、404（华北型）和Eu1（欧洲型）的种子。两种商业moschata材料，金心针4号和金心针11号，用于南瓜改造。在分化和生根阶段将所有组织培养物保持在培养室中。生根后，将再生植物转移到培养箱中约一周，然后在温室中种植，光照条件为 16 小时光照/8 小时黑暗，温度范围为 18°C 至 24°C。

需要使种子发芽以获得外植体，种子发芽的条件如下。将种子在 50°C 的温蒸馏水中浸泡 30 分钟，然后用镊子去除种皮。种子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸钠溶液 15 分钟进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗 6 次。瓜子、南瓜和黄瓜的灭菌种子在 28°C 下在含有 7.5 mL 灭菌水的培养皿上涂抹 1-2 天。在 28°C 下，仅将 Cu2 种子散布在含有 GM 培养基的培养皿上。

sgRNA设计和质粒构建

sgRNA 是使用 CRISPR-GE 网络工具 设计的。如前所述 [ 49 ] 将 sgRNA 插入 pBSE402 载体。简而言之，将含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 缓冲液 3.1 和 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分钟，然后升温以 0.1°C/s 下降到 20°C，产生一个短的双链 DNA 片段。使用限制酶Bsa I 和 T4 连接酶 (New England Biolabs)将短 DNA 片段插入 pBSE402 。将构建的重组载体转化农杆菌菌株EHA105。引物显示在表 S2。

检测 GFP 荧光

为了筛选 GFP 阳性植物，在组织培养阶段使用 Leica MZ10 F 立体显微镜（Leica Microsystems，Germany）检查再生一个月的外植体。在温室中用LUYOR-3415RG激发光源（Luyor Instrument，上海）激发后观察植物的绿色荧光蛋白GFP荧光。将不同感染强度处理的外植体在冰上沿横向和纵向手工切片，在立体显微镜下立即观察到有血管组织部分的GFP荧光。

上图为：（a，b和c）GFP强度，感染维管组织的外植体，以及五种不同处理下甜瓜m1的存活率，分别。数据是三个重复的平均值，误差线表示标准偏差。不同的小写字母表示差异显着（p<0.05，Tukey 检验）。(d) 将再生的转基因 T0 甜瓜植物转移到土壤中。转基因甜瓜 T0 植物的 GFP 荧光顶端分生组织 (e) 和种子 (f 和 g)。LUYOR-3415RG 的 GFP 通道下甜瓜的转基因 T1 植物 (h) 和 WT (i)。组织因 GFP 表达而呈绿色，因叶绿素自发荧光而呈红色。

注：内容为谷歌翻译，并非原作者翻译